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细胞迁移与侵袭 (Transwell法和划痕法)
Transwell法
     
      实验介绍
      将 Transwell 小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
 
      实验步骤:

      1材料准备:
      可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)
 
      2步骤和流程
      2.1基质胶铺板:
       用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。
 
      2.2制备细胞悬液
 
      ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
 
      ②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。
 
      2.3接种细胞
 
      ①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。
 
      ② 24孔板下室一般加入600µl含20S的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。
 
      ③培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
 
      2.4结果统计
 
      直接计数法,“贴壁”细胞计数,这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞。
 
      取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。
 
      0.1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍。
 
      400倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。
 
      实验周期
      2个月
 
      收费标准
      欢迎询价详谈

 
划痕法
      实验介绍
      细胞划痕实验是一种简单易行的检测细胞运动的方法,实验成本低,可以用来检测贴壁生长肿瘤细胞的侵袭转移能力。
      肿瘤细胞在体外仍具有迁移的能力。细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型,在体外培养的单层细胞上,划痕致伤,然后比较不同实验组中肿瘤细胞迁移的能力。

 
    
  1材料准备:
        1、仪器:CO2培养箱、活细胞工作站、超净工作台、酒精灯
        2、试剂及耗材:DMEM培养基、胎牛血清、75%乙醇、PBS溶液、0.25%胰酶溶液、30mm直径细胞培养皿、尺子、Marker笔
        3、细胞株:HUVEC细胞
 
      2步骤和流程 
        (1)培养皿接种细胞之前,先用直尺比着,用Marker笔在背面均匀地画横线标记,大约每隔0.5~1cm一条,一共画5条线;
        (2)取处于指数生长期的HFF-1细胞,胰酶消化后收集细胞沉淀,细胞计数后稀释细胞至2×105个/ml;
        (3)取背面做好标记的培养皿(30mm直径),每皿接种2ml细胞,置于培养箱培养24h;
        (4)取出细胞培养皿,用10μl枪头比着直尺,垂直于底面的横线划痕。
        (5)加入1ml PBS缓冲液,清洗细胞3次,洗去划痕产生的细胞碎片;
        (6)加入2ml无血清培养基,置于活细胞工作站下拍照24h,每个小时拍一张照片;
        (7)根据收集图片数据分析实验结果。


      实验周期
      2个月
 
      收费标准
      欢迎询价详谈

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