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荧光定量 PCR

      实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量,并据此推断目的基因的初始量,不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法,已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。

 

     SYBR Green(荧光染料掺入法):
     在PCR反应体系中,加入SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

     SYBR Green法进行基因定量检测实验设计简单,不需要设计探针即可快速进行基因定量,且能够进行熔点曲线分析,检验扩增反应的特异性,成本低,通用性好,使用比较普遍。


 

 
     TaqmanProbe (探针法):
     PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一段寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时, 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

 

    
        绝对定量:分析未知样本中某个基因的绝对量值,即通常所说的拷贝数。需构建标准品(已知拷贝数的DNA)。
       相对定量:分析未知样本与对照样本中某个基因表达相对变化。需确定内参基因(表达量或拷贝数恒定的基因)。

 

 

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